1143 细菌内毒素检查法修订草案公示稿（第二次）

1143 细菌内毒素检查法修订草案公示稿（第二次）

 1143 细菌内毒素检查法

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。可采用凝胶检测和光度检测技术，共包括以下六种方法：凝胶限度法（方法 1）、凝胶定量法（方法 2）、动态浊度法（方法 3）、终点浊度法（方法4)、动态显色法（方法 5）、终点显色法（方法 6）。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度法结果为准。

本试验操作过程应防止内毒素的污染。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU 与 1 个内毒素国际单位（IU）相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制，并以细菌内毒素国际标准品标定其效价，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号 B 和 C 溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号 B 和 C 溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法检测技术）或小于 0.005EU/ml（用于光度法检测技术）,且对内毒素检查法试验无干扰作用。

鲎试剂是从鲎的血液变形细胞中提取制备中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应，产生假阳性结果。如遇含有β-葡聚糖的样品，可使用去 G 因子鲎试剂或 G 因子反应抑制剂来排除鲎试剂与β-葡聚糖的反应。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、至少 30 分钟）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。

供试品溶液的制备 某些供试品一般采用溶解和（或）稀释等适宜方法或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的 pH 值在 6.0～8.0 的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节 pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。所用溶剂、酸碱溶液及缓冲液应不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的确定 药品、生物制品细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以 EU/ml、EU/mg 或 EU/U（活性单位）表示；K 为人每千克体重或每平方米体表面积每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU/（kg·h）表示，注射剂 K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂 K=2.5EU/（kg·h）注1，鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h），按体表面积给药时K=100EU/

（m 45 2·h）；M 为人用每千克体重或每平方米体表面积每小时的最大供试品剂量，以 ml/

（kg·h）、mg/（kg·h）、或 U/（kg·h）、ml/（m 47 2·h）等表示，人均体重按 60kg 计算，人体表面积按 1.62m 48 2计算。注射时间若不足 1 小时，按 1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以 0.027 即可转换为每千克体重剂量（M）。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定 MVD：

MVD=cL/λ3 / 10

式中 L 为供试品的细菌内毒素限值；

c 为供试品溶液的浓度，当 L 以 EU/mg 或 EU/U 表示时，c 的单位需为 mg/ml或 U/ml，当 L 以 EU/ml 表示时，则 c 等于 1.0ml/ml。如需计算在 MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式 c=λ/L；

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

方法 1 凝胶法检测技术（包括方法 1 和方法 2）凝胶法检测技术系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

 1.预备试验

为保证凝胶法的准确性和有效性，按以下步骤开展鲎试剂灵敏度复核试验和供试品的干扰试验。

鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用 EU/ml 表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

来源：药委会

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