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【指导原则】
基于基因修饰细胞系的生物检定法系采用细胞与分子生物学技术，以药物的作用机制为基础，构建特定基因修饰细胞系，通过检测供试品作用于该细胞的反应信号或指示系统，用于相关产品生物检定的检测方法。本指导原则是对基于基因修饰细胞系的生物检定法的基本技术原则，用于指导具体方法的开发、验证以及数据分析等。
一、基因修饰细胞系的建立
基因修饰细胞系的建立包括细胞的构建、筛选及建库，应确保细胞库的遗传和功能稳定性。
（一）细胞的构建
1．构建策略
应基于待测物的主要效应机制及临床相关性，确定其作用位点（如受体或配体）、胞内信号通路及效应分子，选择响应值高、易检测的信号分子或效应分子作为检测指示物，常见策略及实例如下。
（1）建立细胞反应性
当初始细胞（拟用于基因修饰的细胞）存在适宜的检测指示物，但细胞对待测物反应不敏感（作用位点缺失或表达不足），可通过直接导入作用位点等方式建立其反应性，如，将脑利钠肽受体基因导入HEK293细胞，通过检测环鸟苷酸（cGMP）的含量，测定脑利钠肽生物学活性。
（2）导入检测指示物
当初始细胞缺少适宜的检测指示物，但待测物作用位点表达适量并存在特异性激活的转录因子时，可将相应的DNA反应元件与报告基因序列结合并导入初始细胞，建立反应性报告基因细胞系。通常选择导入的报告基因可表达易被检测的蛋白质或酶，如绿色荧光蛋白、荧光素酶等，作为检测指示物来反映待测物的活性。如，将干扰素刺激反应元件（ISRE）荧光素酶报告基因导入HEK293细胞，通过检测荧光素酶表达量，测定Ⅰ型干扰素生物学活性。
（3）增强细胞反应性同时导入检测指示物
当初始细胞缺少适宜的检测指示物，且对待测物反应不敏感，但存在特异性激活的转录因子时，可同时将作用位点和相应的DNA反应元件报告基因导入初始细胞，建立反应性报告基因细胞系。如，将胰高血糖素样肽1（GLP1）受体基因和cAMP反应元件（CRE）荧光素酶报告基因同时导入CHO-K1细胞，通过检测荧光素酶表达量来测定GLP1及其类似物的生物学活性。
当单一细胞无法满足检测需求，也可采用双细胞报告基因系统，例如抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）活性检测。此外，也可根据待测物的作用特性，选用双报告基因、生物传感器、互补荧光素酶、基因编辑等其他构建策略。
2．构建过程
（1）初始细胞的选择
初始细胞的选择通常基于待测物的作用机制，综合考虑细胞来源、遗传特性、培养特性及待测物作用位点/临床相关性等因素，优先选择遗传背景清晰，容易进行遗传改造；易培养（生长速度、营养需求等），可获得足够的检测所需细胞量；传代稳定，能保持遗传和功能稳定；待测物作用位点表达量高，且具有临床相关性的初始细胞。初始细胞的来源控制可参照生物制品检定用动物细胞质量控制（通则0235）的相关要求。
（2）载体及导入方式的选择
应确定目的基因和载体的来源、核酸序列和功能特性等。常用的病毒载体主要有逆转录病毒、慢病毒和腺病毒等；非病毒载体通常采用磷酸钙共沉淀法、转染试剂法（脂质体和阳离子聚合物等）、电穿孔法、显微注射法等方式将目的基因导入细胞。可根据需求选择合适的载体（商品化或自行构建）/转染方式。载体上可包含适宜的筛选标记，如潮霉素、新霉素、嘌呤霉素等抗性蛋白的编码基因，以筛选稳定的基因修饰细胞。
（3）反应性检测
初始细胞中导入目的基因后（瞬时表达），可采用适宜方法检测拟修饰基因的表达情况，并经过初步实验条件探索（包括待测物的浓度范围、作用时间、分析培养基的成分及含量等），测试细胞的反应性，为保证结果真实可靠，应设置合理的空白对照、阴性对照、阳性对照等。如瞬时表达效率低，可通过加压筛选等方法提高目的基因阳性的细胞比例后再进行反应性检测。
（二）细胞的筛选
将携带目的基因的载体导入初始细胞，在适宜的筛选体系中连续培养以提高目的基因阳性细胞的比例，然后采用有限稀释或流式细胞仪分选等方法进行克隆化分离培养，并根据细胞对待测物的剂量效应曲线，综合比较灵敏度、反应性（如信噪比）、稳定性（如修饰基因、细胞基因型及表型的稳定性）等因素，筛选最佳细胞克隆，作为细胞种子用于建立检测用细胞库。检定用基因修饰细胞系的名称应包括初始细胞、修饰基因等信息。
（三）细胞库的建立
细胞库的建立、管理和质量控制可参照生物制品检定用动物细胞质量控制（通则0235）的相关内容。如必要，在生长培养基中加入维持剂量的筛选试剂，以保证基因修饰细胞的稳定性。应建立细胞库的质量控制，检测项目及方法可依据细胞的特性而定，如，可采用PCR的方法检测外源基因的拷贝数，采用免疫印迹、流式免疫荧光等方法检测目的蛋白的表达情况等。应根据基因修饰细胞的特性及传代稳定性，确定其允许使用的最高限定代次，以及该细胞用于检测最适宜的使用代次范围。
二、基于基因修饰细胞系的生物检定法
基于基因修饰细胞系的生物检定法主要用于生物学活性、效价测定，也可用于某些杂质的含量测定。根据预期目的进行合理的方法设计、建立及优化，以确保所建方法的专属性/选择性、准确度、精密度等性能参数符合预期要求。
（一）定量检测方法设计
基于基因修饰细胞系的生物检定法如用于定量检测，通常可基于方法特性，通过比较供试品和标准品所产生的细胞效应，对供试品中的活性成分进行定量测定。与常规细胞法类似，可根据供试品中待测物的作用机制，选择特异性好、易检测的指示物及相应的检测方法，一般可采用直接法或竞争抑制法进行测定。以最常用的报告基因法为例，直接法是待测物直接作用细胞后，经过一系列信号传导和级联反应，激活DNA反应元件，启动报告基因表达，通过检测报告基因表达量的变化来测定供试品的生物学活性，多用于细胞因子类药物；竞争抑制法是采用特定诱导物刺激细胞，激活报告基因表达，再加入待测物竞争性抑制报告基因的表达，多用于单抗类药物。
（二）方法建立
方法建立通常包括以下步骤：细胞制备、供试品和标准品的制备、加样并孵育、目标指示物的检测。
1．细胞制备
检测用细胞的制备通常在细胞板上进行，可根据细胞和待测物的作用特性，选择在细胞板孔中先接种细胞后加待测物或两者同时进行。某些情况下为降低本底效应需对细胞进行饥饿处理，此外，还应通过合理布局尽可能减少位置效应。
2．供试品和标准品的制备
供试品和标准品的制备应保证其稀释的浓度范围满足量-效反应曲线要求。可预先采用标准品或典型供试品找出其全反应域，然后调整所用剂量使之符合浓度分布点的最低要求。可采用系列稀释或独立稀释两种方式，每个浓度点至少设置两个复孔。
3．加样并孵育
将制备好的供试品、标准品加入细胞板，在适宜条件下孵育，使待测物与细胞充分作用。对于竞争抑制法，可根据具体情况提前或同时加入特定诱导物，某些情况下还需将诱导物与待测物孵育一段时间使其充分结合后再加入细胞板。
4．目标指示物的检测
除少部分可直接检测的目标指示物（如荧光蛋白）外，间接检测的目标指示物通常需在细胞板中加入特定的染料或底物，必要时可同时加入裂解液，经充分反应后，进行信号采集，如吸光度（A）、化学发光或荧光信号。某些情况下，还需要采用酶联免疫吸附（ELISA）、PCR等更加复杂的方式检测目标指示物。
（三）方法优化
对方法参数进行优化，以达到预期性能要求，通常可采取两种策略：单因素轮换试验设计和多因素试验设计。前者是对每个试验参数进行独立优化；后者同时对多个试验参数进行优化，更加快速有效，首先通过流程分析、风险评估及初步试验筛选出关键试验参数，再采用合理的试验设计探索最佳试验参数组合及各实验参数可接受的波动范围。
（四）方法验证
优化后的方法应进行方法学验证，以证明所建方法适用于预期目的，具体原则可参照生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则（指导原则9401）、分析方法验证指导原则（指导原则9101）等。
三、数据分析
数据分析贯穿方法开发、验证和应用的全过程，应符合生物检定统计法（通则1431）相关要求。
（一）数据要求
数据应具有独立性，并满足相应数学模型的统计学要求。如达不到要求，可进行适当的数据转换（对数转换、平方根转换等）。
（二）数学模型
在所用剂量范围内，采用合适的数学模型对量效关系进行线性拟合，如对数剂量与反应（或反应的函数）呈直线关系，统计模型为线性模型；如呈S形曲线关系，常用的统计模型为四参数模型。
（三）适用性测试
1．系统适用性
常用的两个指标是模型的拟合优度和数据的精密度。前者通常采用模型的决定系数（R2）、失拟F检验等进行评价；后者用标准品模型拟合的均方误差，或标准品和供试品模型拟合的总均方误差进行评价。一般使用历史数据和灵敏度分析来设定可接受的阈值。
2．样品适用性
生物检定的模型要求供试品和标准品中的活性成分必须性质相同才能计算其相对效价，即两者需具有相似性，一般通过量效曲线的平行性来评价，可采用差异性检验（如F检验、卡方检验）或等效性检验（如双单侧t检验法）。此外，还应考虑样品基质是否对测试系统产生干扰。
（四）结果计算
根据数学模型采用合适的计算方式，通过比较供试品与标准品的量效关系计算供试品中待测物的生物学活性、效价或其他量值。
